507 特許特許研究室シルクパウダー


特集|緑茶カテキン

緑茶に含まれるカテキンの一種と男性機能不全(ED)治療薬を併用投与することで、正常な細胞を傷つけずにがん細胞のみを殺し、高い抗がん作用を発揮することを、九州大大学院農学研究院の立花宏文教授の研究チームが突き止めた。研究成果は25日、米医学誌ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション電子版に掲載された。
 立花教授によると、これまで抗がん剤が効かなかったケースでも、高い効果が期待できるという。早ければ年内にも米国で臨床実験を実施する。同教授のチームは2004年、「エピガロカテキンガレート(EGCG)」と呼ばれるカテキンの一種ががん細胞の細胞膜表面にあるたんぱく質と結合することで、がん細胞を特定して殺す仕組みを解明。今回の研究では、EGCGの抗がん作用を阻害する酵素に着目し、この酵素の働きを抑える化合物を含むED治療薬を投与したところ、抗がん作用を高めることに成功した。
 マウスにヒトの乳がん細胞を移植した実験では、2日に1回、EGCGとED治療薬を投与した結果、16日間でがん細胞が死滅した。多発性骨髄腫や胃がん、膵臓(すいぞう)がん、前立腺がんでも同様の効果が得られたという。

 今回は、この研究の知財を俯瞰し今後の展開を考えてみる。

九州大学農学研究院 生物機能科学部門助教授 
立花宏文「緑茶の渋みは健康増進シグナル?−緑茶カテキンの機能とその受容体−」より

 茶(Camellia sinensis)は、ツバキ科に属する多年生の常緑樹で、その発祥地は中国南西部の亜熱帯地方と考えられています。その歴史は数千年ともいわれ、世界中で最も愛用されている嗜好飲料です。製法的な違いによって、不発酵茶(緑茶)、発酵茶(紅茶)、半発酵茶(ウーロン茶や包種茶)などがあります。その茶葉中にはタンパク質や食物繊維などの不溶性成分が多く含まれていますが、その他にも苦味の素であるカフェイン、渋味の素であるカテキン類、旨味の素であるテアニン等のアミノ酸やビタミン類、フラボノイド、微量金属類、サポニンなどが含まれています。なかでも数多くの生理作用が報告されているのがカテキン類です。緑茶葉には乾燥重量で約十〜二十%のカテキン類が含まれていますが、その約半量を占めるのがエピガロカテキンガレート(EGCG)であり、エピカテキンガレート(ECG)、エピガロカテキン(EGC)、エピカテキン(EC)といった他のカテキン類と比較して強い生理活性を有していることが明らかとなっています。また、EGCGは茶以外の植物には見出されていないことや、ウーロン茶や紅茶にはほとんど含まれていないことから緑茶を特徴的づける成分といえます。
 カテキンの生理作用として、抗酸化作用、抗ガン作用、抗アレルギー作用、血圧上昇抑制作用、動脈硬化抑制作用、脂質代謝改善作用などが報告されており、お茶による生活習慣病の予防効果に期待が寄せられています。

緑茶カテキンに受容体があるのでは

カテキン類の保健作用はこれまで、その高い抗酸化活性と関連させたものがほとんどでした。これに対して、私たちは、緑茶カテキンがガン細胞の増殖を抑制し、その抑制効果がカテキンの種類によって著しく異なること、さらに、抑制効果のあるEGCGはガン細胞の表面に結合することができるが、抑制効果のないカテキンには結合性がないことを見出してきました。こうした結果から、緑茶カテキンを受け取ってその生理作用を仲介する分子が細胞表面上に存在するのではないかと考えました。しかし、そのような分子の存在はこれまでに報告されていなかったため、テキンの細胞表面上の標的分子を遺伝子工学的手法により明らかにしました

緑茶カテキン受容体としての67kDaラミニンレセプター

67kDaラミニンレセプター(67LR)は、基底膜の主要な構成成分であるラミニンに結合する細胞膜タンパク質で、悪性度の高いガン細胞に高発現し、その増殖、浸潤、転移などに関与することが知られています。また、この67LRは、プリオンタンパク質の受容体としても機能することが知られており、最近では病原性プリオンタンパク質の増殖に関与していることが明らかにされた分子でもあります。遺伝子学的手法による検討の結果、この67LRが緑茶カテキンの受容体として働く可能性を見出したため、以下に示した実験を行いました。

(2)EGCGのガン細胞増殖抑制作用には67LRが必要である

67LRが緑茶カテキンのガン細胞の増殖抑制作用を仲介するかについて明らかにするため、ヒト肺ガン細胞株A549に67LR遺伝子を導入しました。その結果、67LR遺伝子を入れた細胞67LR(+)では、遺伝子を入れていない67LR(-)と比べて、細胞表面上の67LRの発現量が増えました。また、EGCGの細胞増殖への影響を調べた結果、67LR遺伝子を入れてない細胞@とAあるいは67LR遺伝子を入れてEGCGを加えてない細胞Bではぎっしりとなるまで細胞が増えたのに対し、67LR遺伝子を入れてEGCGを加えた細胞Cでは、細胞の増殖が抑制されていました。一方、RNAiという手法で67LRの発現を低下させるとEGCGの結合性とその細胞増殖抑制活性がともに消失しました。
 これまでEGCGの抗ガン作用に関する研究の多くは、10〜100μMという濃度で行われてきました。しかしながら、私たちが数杯のお茶を摂取しても、EGCGは血中に約1μM程度しか認められません。そこで、67LRをより多く発現させたガン細胞を用いて生理的な濃度(1μM)におけるEGCGの作用について検討したところ、顕著にその増殖が抑えられました。一方、67LRに対する抗体でその細胞の表面に発現している67LRを塞ぐと、EGCGの結合が低下するとともに、その細胞増殖抑制作用も阻害されることがわかりました。すなわち、67LRは生理的な濃度におけるEGCGの作用を仲介する分子ということができます。

(3)67LRは茶成分の中でEGCGを特異的に細胞表面で受け取りEGCGの生理作用を細胞に伝達する

緑茶にはカテキン以外にもカフェインなどの生理活性物質が多く含まれています。そこで、この67LRがこうした他の茶成分のガン細胞への結合性や増殖抑制作用を仲介することができるか検討しました。その結果、EGCG以外の茶成分では67LRの発現に関わらず細胞表面における結合性は認められませんでした。また、EGCGにおいて観察されたような顕著な細胞の増殖抑制効果も示されませんでした。これらの結果から、67LRはEGCGの特異的な受容体であり、その生理作用を仲介していることが明らかとなりました。

今後について

本研究では、緑茶カテキンの抗ガン作用を仲介する受容体として67LRが機能することを見出しました。現在、緑茶カテキンの他の生理作用についても67LRが関与しているか検討しています。もし、多彩な生理作用が67LRへの結合を介したものであるとすると、67LRの発現を増強することで緑茶カテキンの作用を受け取りやすくするような食べ合わせがあるのではないか、67LRの発現の仕方の違いによりカテキン作用の個人差があるのではないか、等々「健康増進シグナルとしての緑茶カテキン」の可能性を探るのが目下の課題です。



特開2011-162506|エピガロカテキンガレート誘導体及びそれを含む医薬組成物

Fターム
4C062 4C086

要約

エピガロカテキンガレートのヒドロキシ基の一部がメトキシ基に置換されており、エピガロカテキンガレートと同等又はそれ以上の抗腫瘍活性又は抗アレルギー活性を持つ誘導体の提供。

〔式中、Xは疎水性基を表し、R1及びR2は同一又は異なって、置換基を有していてもよいフェニル基を表す。〕で表される化合物。



概説

エピガロカテキンガレートは、in vitro の評価系において抗腫瘍作用や抗アレルギー作用などの様々な作用を有するが明らかになっているが、体内動態はよくないことが知られている。エピガロカテキンガレートのヒドロキシ基の一部がメトキシ基に置換された誘導体は、体内動態の向上が期待できる。エピガロカテキンガレートのD 環部のヒドロキシ基の一部がメトキシ基に置換された誘導体は、in vivo で抗アレルギー作用を示すことが明らかにされており(非特許文献1、非特許文献2、非特許文献3)、そのようなエピガロカテキンガレート誘導体を含む「べにふうき」は、アレルギー症状を抑える効果があることが証明されている。しかし、そのような誘導体は、in vitro 評価系では、オリジナルのエピガロカテキンガレートよりも活性が低下することが明らかにされている。

【非特許文献1】J. Agric. Food Chem. 2002, 50,5729-5734 5729
【非特許文献2】The Journal of Immunology, 2004,172: 4486-4492.
【非特許文献3】Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 364 (2007) 79-85
【非特許文献4】J. Agric. Food Chem. 2007, 55,7144-7148

上述したように、エピガロカテキンガレートのヒドロキシ基の一部をメトキシ基に置換した誘導体は、体内動態が向上するもののエピガロカテキンガレートよりも活性が低下してしまう。本発明は、以上のような技術的背景の下になされたものであり、エピガロカテキンガレートのヒドロキシ基の一部がメトキシ基に置換されているが、エピガロカテキンガレートと同等又はそれ以上の抗腫瘍活性又は抗アレルギー活性を持つ誘導体を提供することを目的とする。

特開2010-248201|67kDaラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物

Fターム
4C062 4C086

要約

被験化合物と67kDaラミニン・レセプターとの結合の度合いを定性的または定量的に測定し、その測定結果より被験化合物が67kDaラミニン・レセプターに結合する場合にはその被験化合物が細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び/または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物であると判断する工程を含む、細胞増殖抑制作用、血管新生阻害作用、癌細胞の転位活性阻害作用、神経保護作用、抗アレルギー作用、抗動脈硬化作用、及び/または、クロイツフェルトヤコブ病感染阻害作用を有する薬物のスクリーニング方法、並びに、それにより得られる薬物で67kDaラミニン・レセプターを用いた薬物の新規なスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物を提供する。





特開2012-231786|標的遺伝子の発現変化による食品機能成分及び医薬品感受性評価方法

Fターム
2G045 4B024 4B063

要約

所定の遺伝子群のうち1又は複数の遺伝子に対する被験物質の作用を判定する方法であって、被験物質が接触、摂取又は投与された被験生物から採取された試料から、下記の遺伝子群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子を検出し、得られた検出結果を、被験物質の作用と関連づけることを特徴とする方法。





脚注及び関連項目

    1. Tanaka H, Yamanouchi M, Miyoshi H, Hirotsu K, Tachibana H, Takahashi T. Solid-phase synthesis of a combinatorial methylated (±)-epigallocatechin gallate library and the growth-inhibitory effects of these compounds on melanoma B16 cells. Chem Asian J. 2010;5(10):2231?2248. View this article via: PubMed CrossRef
    2. 67-kDa laminin receptor increases cGMP to induce cancer-selective apoptosis, Clin Invest. doi:10.1172/JCI64768. Published January 25, 2013、Received for publication May 11, 2012, and accepted in revised form November 1, 2012.


    3. Figure 1   67LR-dependent NO production by activation of Akt and eNOS is a key event in the EGCG-induced cell death pathway.
      (A) Primary MM cells, MM cell lines (U266 and RPMI8226), and normal PBMCs were cultured for 3 hours in the absence or presence of 5 μM EGCG. NO production was measured using the fluorescent probe DAF-2DA. FU, fluorescence units. (B) Cells were pretreated with control antibody or anti-67LR antibody (20 μg/ml) and treated or not with EGCG for 3 hours. Phosphorylation of eNOS at Ser1177 was measured by Western blotting. Lanes were run on the same gel but were noncontiguous (white lines). (C) U266 cells were pretreated or not with the NOS inhibitor l-NAME (10 mM), then cultured in medium with or without 10 μM EGCG for 96 hours. (D) Left: Immunoblot analyses of eNOS knockdown in U266 cells. Right: Sensitivity of U266 cells to EGCG (10 μM for 96 hours) after eNOS knockdown. (E) Effect of 5 μM EGCG on Akt activity. (F) Cells were pretreated with control antibody or anti-67LR antibody (20 μg/ml) and treated or not with 5 μM EGCG for 1 hour. (G) U266 cells were pretreated or not with 5 μM AKT1/2 kinase inhibitor, then cultured in medium with or without 5 μM EGCG for 3 hours. All data are mean ± SEM.

      Figure 2.   67LR acts as a death receptor via cancer-specific cGMP upregulation.
      (A) Effect of EGCG on cGMP levels in normal PBMCs and primary MM cells for 3 hours. (B) U266 cells were preincubated with anti-67LR antibody (20 μg/ml) or IgM control antibody (20 μg/ml), then treated or not with 10 μM EGCG for 3 hours. (C) Effect of the sGC inhibitor NS-2028 on cGMP upregulation. U266 cells were preincubated or not with 5 μM NS-2028 for 1 hour, then treated or not with 10 μM EGCG for 3 hours. (D) Effect of NS-2028 on cell death induced by EGCG. U266 cells were preincubated or not with 5 μM NS-2028 for 1 hour, then treated or not with 10 μM EGCG for 96 hours. (E) Effect of NS-2028 on EGCG-induced ASM activation, measured by TLC analyses. U266 cells were preincubated or not with 5 μM NS-2028 for 1 hour, then treated or not with 10 μM EGCG for 3 hours. (F) U266 cells were treated with 10 μM EGCG or its analogs for 3 hours, and cGMP levels in cells were measured using a competitive immunoassay. n = 3 per group. All data are mean ± SEM.


      Figure 3 Abnormal overexpression of PDE5 attenuates EGCG-induced cell death in MM cells.
      (A) MM cells were pretreated with the PDE1 inhibitor 8-Met-IBMX (20 μM), with the PDE4 inhibitor rolipram (10 μM), with the PDE5 inhibitors zaprinast (10 μM), sildenafil (10 μM), vardenafil (5 μM), and MQZ (10 μM), or with theophylline (20 μM), then treated or not with 5 μM EGCG for 96 hours. ***P < 0.001. (B) Cells were treated with or without 5 μM vardenafil and/or 5 μM EGCG for 96 hours. Phase-contrast images were taken by optical microscopy. Original magnification, ×20. (C) Expression of 67LR and PDE5 proteins in patient cells and normal PBMCs, assessed by immunoblotting. Lanes were run on the same gel but were noncontiguous (white lines). (D) Correlation between 67LR expression and PDE5 expression. (E) Top: Immunoblot analyses of PDE5 in U266 cells. Bottom: EGCG sensitivity (5 μM for 96 hours) of U266 cells after PDE5 knockdown. (F) Normal PBMCs from 10 healthy donors, primary MM cells from 10 patients, and MM cell lines were treated with or without 5 μM vardenafil and/or 5 μM EGCG for 96 hours. (G) U266 cells were incubated for 96 hours with or without 5 μM vardenafil and/or 5 μM EGCG analogs (see Figure 2F). n = 3 per group. All data are mean ± SEM.


      Figure 4    Effect of EGCG and a PDE5 inhibitor in combination on myeloma cell proliferation in vivo.
      (A) Anti-MM effect of EGCG (5 μM) and vardenafil (5 μM) in combination and of lenalidomide for 96 hours in vitro (n = 3). (B) Mouse myeloma MPC-11 cells were pretreated or not with 5 μM vardenafil for 3 hours and cultured in the presence or absence of 5 μM EGCG for 96 hours (n = 3). (C?E) MPC-11 cells were injected subcutaneously into female BALB/c mice, and mice (n = 5 per group) were given single i.p. injections of EGCG (15 mg/kg) and/or vardenafil (5 mg/kg). (C) After 6 hours, tumors were excised and evaluated for phosphorylation of PKCδ at Ser662 (corresponding to human p-PKCδSer664). Original magnification, ×60. (D) ASM activation, assessed by TLC analyses. (E) Cleaved caspase-3 was evaluated by immunofluorescence analyses. Original magnification, ×60. (F and G) MPC-11 cells were injected subcutaneously into female BALB/c mice, and mice (n = 10 per group) were given i.p. injections of EGCG (15 mg/kg) and/or vardenafil (5 mg/kg) every 2 days. Statistical analyses of survival curves were undertaken using log-rank analyses of the Kaplan-Meier curves. All data are mean ± SEM.


      Figure 5    Caspase activation and collapse of Δ?m are involved in 67LR-dependent cell death.
      (A) U266 cells were treated or not for 96 hours with 5 μM EGCG in the presence or absence of 5 μM vardenafil and observed under a fluorescence microscope. Original magnification, ×20. (B and C) Apoptotic cells were double stained with annexin V?Alexa Fluor 488 and PI. (D and E) U266 cells were treated or not for 72 hours with 5 μM EGCG in the presence or absence of 5 μM vardenafil, and caspase activity (D) and collapse of Δ?m (E) were measured. (F) U266 cells were treated for 96 hours with 5 μM EGCG in the presence or absence of 5 μM vardenafil. Flow cytometric analyses of PI staining for cellular DNA content. Sub-G1 fractions were determined by FlowJo. n = 3 per group. All data are mean ± SEM.



      Figure 6    Inhibition of PDE5 potentiates 67LR-dependent cell death by enhancing the 67LR-dependent signaling pathway in MM cells.
      (A) U266 cells were preincubated for 3 hours with anti-67LR antibody or IgM control antibody, then treated or not for 96 hours with 5 μM EGCG and/or vardenafil. Apoptotic cells were double stained with annexin V?Alexa Fluor 488 and PI and analyzed by flow cytometry. (B) Cells were pretreated or not with 5 μM vardenafil and cultured for 3 hours in the presence or absence of 5 μM EGCG, followed by measurement of the amount of cGMP in the cells. (C) U266 cells were treated or not for 96 hours with the sGC activator BAY 41-2272 (1 μM) in the presence or absence of 5 μM vardenafil. (D) U266 cells were preincubated or not for 3 hours with the ASM-specific inhibitor desipramine (Des; 5 μM), then treated or not for 96 hours with 5 μM EGCG and/or vardenafil. (E) Sensitivity of U266 cells to EGCG and/or vardenafil (5 μM for 96 hours) after ASM knockdown. n = 3 per group. All data are mean ± SEM. (F) The combination of EGCG as a cancer-specific cGMP inducer with an inhibitor targeting cancer-overexpressed PDE5 could be a useful strategy for cancer-selective chemotherapy. Left: In the absence of PDE5 inhibitor, overexpressed PDE5 in cancer attenuates the anticancer effect of EGCG. Right: PDE5 inhibition potentiates the anticancer effect of EGCG.


      Figure 7   PDE5 is overexpressed in various types of human cancer.
      (A) NHDFs from healthy donors as well as cell lines MKN45 (gastric cancer), PANC-1 (pancreatic cancer), and PC3 (prostate cancer) were cultured for 96 hours with 5 μM vardenafil and/or 5 μM EGCG. (B) Representative images of paraffin sections of various types of tissue from cancer patients. Original magnification, ×60. n = 3 per group for all in vitro studies. All data are mean ± SEM.


      Figure 8   PDE5 inhibition potentiates the anticancer effect of EGCG.
      (A) MDA-MB-231-RFP cells were cultured for 96 hours with 5 μM vardenafil and/or 5 μM EGCG. (B and C) MDA-MB-231-RFP cells were injected subcutaneously into female nude mice, and mice (n = 8 per group) were given EGCG (15 mg/kg i.p.) and/or vardenafil (5 mg/kg i.p.). (D) PANC-1 cells were treated for 96 hours with 5 μM EGCG and/or 5 μM vardenafil. Cells were treated with annexin V?Alexa Fluor 488. Original magnification, ×20. (E) PANC-1 cells were treated with 5 μM EGCG and/or 5 μM vardenafil or with the conventional drug gemcitabine for 96 hours. (F) Clonogenic assay in PANC-1 cells. 1,500 PANC-1 cells were cultured for 10 days with 5 μM vardenafil in the presence or absence of 5 μM EGCG. n = 3 per group for all in vitro studies. All data are mean ± SEM.

    4. 緑茶カテキン受容体67LR を介したカテキンの機能性発現機構、日薬理誌(Folia Pharmacol. Jpn.)132,145〜149(2008)、立花宏文
    5. ラミニンレセプターのラミニン結合部位を基にした抗菌ペプチド設計方法、先端科学研究所 バイオインフォマティックスグループ 小林 菜穂子 吉田 徹彦、東亞合成グループ研究年報 5 TREND 2009 第12号
    6. 特開2012-231786 標的遺伝子の発現変化による食品機能成分及び医薬品感受性評価方法 国立大学法人九州大学 他
    7. 特開2011-162506 エピガロカテキンガレート誘導体及びそれを含む医薬組成物 国立大学法人東京工業大学 他
    8. 特開2010-248201 67kDaラミニン・レセプターを用いた薬物のスクリーニング方法及びそれにより得られる薬物 株式会社産学連携機構九州
    9. 特開2009-143928 ガロイルカテキン類の抗酸化活性の促進方法 国立大学法人九州大学
    10. 特開2009-096761 天然物由来の抗アレルギー剤 塩野香料株式会社 他
    11. 特開2009-057340 細胞増殖抑制剤 国立大学法人九州大学
    12. 特開2007-063234 カテキン結合ペプチド 国立大学法人九州大学
    13. 特開2003-171272 10トランス,12シス−共役リノール酸を有効成分とする抗腫瘍剤 リノール油脂株式会社 他






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